面向长期太空任务中宇航员的蛋白质供给，团队以氢氧化细菌 Cupriavidus necator H16 为底盘，自养合成人源 α-乳白蛋白（αLA，UniProt P00709）；并通过理性设计在 C 端引入胰蛋白酶切位点（E121K/R），让消化产物更多落在 PepT1 可吸收的二/三肽上。我作为 Student Leader 统筹干湿两线，亲手完成菌株基因改造筛选与 αLA 的表达纯化。
长期太空任务里，宇航员的优质蛋白补给是一个现实约束。团队的设想是：与其从地球运送，不如让微生物在站内利用宇航员代谢废物（尿素提供氮源）与 CO₂ 自养合成人体所需的蛋白。
选择人源 α-乳白蛋白而非牛源/羊源，是出于营养与可表达性的综合考量。它与人体需求的氨基酸组成更匹配、过敏原性更低、消化吸收率高（>90%）；支链氨基酸（BCAA）含量约为牛源的 1.5 倍，有助对抗微重力引起的肌肉萎缩；色氨酸含量高，半胱氨酸水解产物具抗氧化活性；分子量仅约 14 kDa、结构相对简单，利于异源表达。
小肠经 PepT1（SLC15A1）高效转运二/三肽。若能让 αLA 的胰蛋白酶消化产物优先生成二/三肽，吸收效率即可提升。胰蛋白酶特异地切在 Lys/Arg 之后——因此在合适位置引入 K/R，就能"设计"出新的切割位点与产物。
候选位点不是拍脑袋选的，而是经过一条可复核的筛选：先用演化保守性与溶剂可及性圈出"可改造、在表面"的位点，再用 ΔΔG 共识与分子对接判断"改了稳不稳、酶切好不好"，最后以分子动力学验证整体构象不被破坏。
以人源 αLA 为探针做多序列比对、建系统发育树，用 Shannon 熵 量化每个位点的可变性（熵越高越可改）；再叠加 SASA 选取表面暴露残基。C 端区（含 121、122、123）在高可变 + 高暴露列表中集中出现，被定为改造热点。低 SASA 的深埋残基（如 A92，SASA 仅 3.63%）即便 ΔΔG 友好也予排除。
用 CUPSAT（经验势）与 MUpro（SVM）两种不同原理的方法做共识 ΔΔG 筛选，预警阈值 +2.0 kcal/mol；再用分子对接评估改造后与胰蛋白酶的结合（STRING 验证两者存在功能相互作用，得分 0.449）。两者交叉确认 E121K/R 既不失稳、又改善酶切几何。
| 突变 | CUPSAT ΔΔG | MUpro ΔΔG | 评级 |
|---|---|---|---|
| E121K | −0.20 | −0.54 | 两法均预测更稳定 · 最优，选定 |
| E121R | −0.24 | −0.40 | 两法均预测更稳定 · 优，选定 |
| L123K | −0.28 | +0.11 | 两法结果冲突，风险极低（次优） |
| L123R | −0.54 | +0.32 | 两法结果冲突，风险低 |
| I98K | +0.86 | +0.12 | 轻微去稳定，远低于阈值 |
| A92K | −0.43 | −0.02 | 稳定但 SASA 仅 3.63%，功能可及性差 · 排除 |
| L26K | +0.55 | +0.23 | 去稳定 · 放弃 |
| L26R | +1.14 | +0.40 | 去稳定（CUPSAT >1.0）· 放弃 |
| 指标 | 野生型 | E121K | E121R | 方向 |
|---|---|---|---|---|
| 结合得分（Docking Score） | −287.67 | −372.37 | −315.40 | 越负越好 |
| 界面氢键数 | 7 | 12 | 11 | 越多越好 |
| 配体 RMSD（nm） | 0.35 | 0.22 | 0.25 | 越小越稳 |
| 催化距离（Å） | 5.8 | 3.5 | 3.7 | 落入理想范围 |
⑤ 全原子分子动力学（MD）：用 RMSD / RMSF / 回转半径 / DSSP 及关键氢键占有率，验证突变不破坏整体折叠与钙结合环构象（分析框架已设计）。
这张约束图也埋下了后续个人研究的种子：改造位点 121 紧邻跨度最大的 6–120 长程二硫桥一端（Cys120）。当湿实验未达预期时，正是这处"紧邻硬约束"的细节，把我引向"序列模型是否真的可靠刻画了这些二硫键"的问题 —— 详见 机器学习 · 蛋白校准。
在投入湿实验前，先用基于 C. necator H16 基因组尺度模型的 COBRApy 框架评估可行性：pFBA / FVA 分别在自养（H₂/CO₂）与异养条件下估算最大生长速率与 αLA 合成通量，并用 Trade-off 曲线刻画碳氮约束。
迭代敲除筛选出 14 个能显著提升生物量的反应，最终选定敲除 H16_A3598（乙醛酸碳连接酶），减少乙醛酸支路通量、把更多碳引向 TCA 循环与氨基酸/能量供应；并用 Escher 图可视化核心通量。结论是：自养条件下产 αLA 在机理上可行（"低产但可行"），且产物合成随生长率同步增加。
数据为模型估算（pFBA/FVA），用于可行性论证，非湿实验测得产量。
干实验给出方向后，湿实验把人源 αLA 真正在 C. necator H16 里表达出来、纯化出来、定量出来。这是我个人投入最深的部分。
Para-RBS1 骨架，Gibson Assembly 克隆 hLALBA（C 端 6×His）与分子伴侣。
比较 4 种启动子后选定 PBAD（阿拉伯糖），约 800× 诱导、近零本底。
抗 His 抗体 Western Blot 检出预期分子量条带，未诱导组几乎无信号。
1 L 扩培→超声裂解→Ni-NTA 亲和层析；SDS-PAGE ≈14.2 kDa；BCA 定量。
为帮助二硫键折叠，设计了两组伴侣共表达：Group A 为 hPDIA3（ER 氧化还原折叠酶）；Group B 原计划 KAR2+SLY1，但 KAR2 反复克隆失败，最终仅保留 SLY1（单独克隆成功）。这类"方案随实验现实迭代"的取舍，是工程过程的常态。
以尿素为唯一氮源培养 C. necator H16：10 天内 OD 显著上升、生长稳定，而仅含硫酸铵的对照生长极弱——支持"利用宇航员代谢废物自养产蛋白"的设想。Group A（hPDI）在尿素条件下生长优于 Group B（SLY1）。
| 菌株 / 宿主 | 250 mM 咪唑洗脱 | 500 mM 咪唑洗脱 |
|---|---|---|
| Group A（hLALBA-hPDI）· C. necator | 197.41 | 139.92 |
| Group B（hLALBA-SLY1）· C. necator | 182.82 | 135.63 |
| A7E（Group A）· E. coli | 332.13 | — |
| B1E（Group B）· E. coli | 202.56 | — |
作为 Student Leader，我统筹干实验设计与湿实验验证两条线及跨学科协作，并亲手完成菌株基因改造筛选与人源 αLA 的表达纯化。
这个项目让我完整走过一次"计算设计 → 构建表达 → 纯化验证"的闭环，也让我直接体会到干预测与湿结果之间的落差——E121K/R 在干实验中评分优异，湿实验却未达预期。这处落差没有被搁置，而是变成了我个人研究的起点：与其继续设计，不如先回头检验"我所依赖的模型，是否真的可靠"。这条线索通向我的 蛋白校准研究，也贯穿到我在 数据分析 与 模型训练 中关心的同一件事：让模型与数据的判断，在被采用之前先经得起检验。