在 iGEM 阶段，干实验为 α-乳白蛋白预测了改造位点（E121K / E121R），但相应的湿实验结果未达预期。该位点紧邻二硫键半胱氨酸 Cys120，这促使我转向一个更基础的问题：ESM2 这类序列模型，是否真的可靠地刻画了这一含四对二硫键的蛋白？本项目即针对这一问题，对模型在该蛋白上的预测进行系统校准。
本项目起源于 iGEM 2025。团队对 α-乳白蛋白引入 E121K / E121R 改造；依据团队 wiki 的设计目标，意在该位点引入胰蛋白酶切位点，以提升其经 PepT1 的消化吸收。改造位点由干实验预测，但相应的湿实验结果未达预期。
复盘时我注意到一个被先前忽略的细节：改造位点 121 紧邻 Cys120，而后者是四对二硫键中跨度最大的 6–120 二硫桥的一端。由此产生一个直接的疑问——在动手改造之前，所依赖的模型是否真的可靠地刻画了这个蛋白的二硫键约束？这一点此前并未验证。项目因此从"设计更优的蛋白"转向"先检验模型在该蛋白上的可靠性"。
本项目不含湿实验，不对功能改进作出经实验验证的结论；它要回答的是模型可靠性，而非蛋白性能。本研究承接 01 · 生物 · iGEM 中那次未达预期的 E121K/R 改造。
α-乳白蛋白适合用来检验这一问题：它的折叠高度依赖多对二硫键，而长程、成对的共价约束正是纯序列模型容易忽略之处。
本项目统一以成熟编号为基准，每张输出表同时标注 uniprot_pos 与 mature_pos，以避免编号歧义。
思路是把该蛋白已知的生物学约束——首先是 8 个参与二硫键的半胱氨酸——作为标尺，检验模型能否召回这些它本应掌握的约束。
具体做法：用 ESM2-650M（masked-marginal）对全序列逐位点打分，再核对它在每个二硫键半胱氨酸上的判断。若模型连已知的二硫键都无法可靠识别，那么它在该蛋白上的其余预测同样不可轻信；在可靠性得到确认之前，我不据此提出改造方案。
→ 这一校准的实测结果（含逐残基 LLR 与数据出处）见 第 2 页 · 校准发现。